一、研究背景

N-糖基化作為最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，在蛋白質折疊、細胞識別、信號傳導和免疫應答等生物學過程中發揮關鍵調控作用，但由于聚糖結構的高度復雜性和微觀不均一性（即同一糖基化位點可攜帶多種不同聚糖結構），系統性解析組織間糖蛋白組全貌一直面臨重大技術挑戰。盡管小鼠作為生物醫學研究的核心模式生物，其基因組、轉錄組、蛋白質組和磷酸化修飾組已有較系統的組織圖譜，但糖蛋白組的組織特異性景觀長期缺乏高分辨率、大規模的系統性描繪——傳統糖組學分析游離聚糖雖然能揭示部分組織差異，卻丟失了聚糖所附著的蛋白載體和糖基化位點信息，導致功能解讀受限；而現有的糖蛋白組學工具多依賴于預設聚糖組成數據庫，難以區分具有不同生物學功能的同分異構體結構。因此，亟需建立一種能夠同時解析聚糖精細結構、糖基化位點和蛋白載體信息的技術體系，從分子層面全面揭示N-糖基化在小鼠不同組織中的分布規律、功能意義及其調控機制。

二、關鍵技術總結

樣本制備與糖肽富集技術
研究首先從24種小鼠組織（涵蓋8大系統，含7個腦區及血清）中提取蛋白并酶解為肽段。為高效富集完整糖肽，采用親水相互作用色譜（HILIC）與混合型陰離子交換色譜（MAX）兩步串聯策略，顯著去除非糖肽干擾。對于22個組織，進一步通過高pH反相高效液相色譜將HILIC富集的糖肽分級為6個餾分，有效降低樣本復雜度，大幅提升了糖肽鑒定的深度和覆蓋度。

質譜數據采集與雙碰撞能碎裂策略
富集后的糖肽經納升液相色譜分離后，由Orbitrap Fusion Lumos高分辨質譜進行分析。核心技術創新在于對每個糖肽前體依次采用兩種碰撞能進行數據依賴性采集：較高的HCD能量（33%）用于碎裂肽段骨架以鑒定氨基酸序列，而較低的HCD能量（20%）則用于保留并解析完整的聚糖結構信息。這種雙碰撞能策略實現了在一針進樣中同時獲取肽段和聚糖兩層信息，避免了分別進樣帶來的匹配誤差，為后續結構解析提供了高質量譜圖基礎。

基于StrucGP的聚糖結構從頭解析與鑒定
數據分析的核心工具為課題組自主開發的StrucGP軟件。與傳統工具依賴預設聚糖組成數據庫不同，StrucGP利用低能譜圖中特征性的B離子（聚糖碎片）和Y離子（肽段+部分聚糖碎片），采用模塊化策略從頭解析N-聚糖的精細結構，能夠明確區分具有相同單糖組成但連接方式不同的同分異構體。結合UniProt小鼠蛋白數據庫搜索，分別在肽段水平和聚糖水平均設定1%的假fa現率（FDR），確保了鑒定結果的高可靠性。

機器學習驅動的置信度評估與生物信息學分析
為系統評價聚糖結構鑒定的可信度，研究構建了基于邏輯回歸的置信度評估框架。以人工標注的774張譜圖、472種聚糖作為金標準訓練集，輸入包括譜圖匹配分數、GlyTouCan數據庫匹配、聚糖類型概率、分支結構概率和生物合成路徑合理性等5項特征，經交叉驗證優化后為每個聚糖輸出0–1的置信度分數。最終88.2%的聚糖被歸為高置信度（≥0.82），僅高置信度數據用于后續生物學分析。在此基礎上，研究進一步運用聚類分析、PCA降維、GO功能富集、糖基轉移酶表達關聯分析及共現網絡構建等多種生物信息學手段，系統揭示了組織特異性糖基化模式及其調控規律。

研究通過“雙碰撞能質譜碎裂 + StrucGP結構解析 + 機器學習置信度評估"三位一體的技術體系，實現了在不依賴預定義聚糖庫的前提下高置信度地區分N-聚糖同分異構體，完成了小鼠多組織N-糖蛋白組的結構分辨率級系統繪制。

三、主要研究成果

1、24種小鼠組織N-糖蛋白組數據總覽

通過對24種小鼠組織的195萬余張含氧鎓離子特征譜圖進行嚴格篩選與鑒定，在肽段水平1%假fa現率（FDR）控制下，鑒定出17,806條含糖基化位點的肽段，對應13,934個N-糖基化位點和7,365個N-糖蛋白；進一步在聚糖水平同樣以1% FDR過濾后，獲得74,277個獨特的完整糖肽，包含3,045種具有明確結構特征的N-聚糖，其中2,687種（88.2%）被歸類為高置信度，后續分析主要基于此子集、8,681個糖基化位點和5,026個糖蛋白，構成了迄今大的哺乳動物組織特異性糖蛋白組資源之一。在結構新穎性方面，鑒定的3,045種聚糖中有76.3%的組成和34.2%的精細結構已在國際聚糖結構數據庫GlyTouCan中有過記錄，說明本研究在聚糖結構層面貢獻了大量新發現。為確保數據可靠性，作者建立了基于邏輯回歸的整合置信度評估框架——以人工標注的472種聚糖（分屬“結構合理"與“結構存疑"兩類）為金標準訓練集，模型表現出良好的判別能力（AUC=0.79，F1=0.70），并通過統計優化的閾值將88.2%（2,687種）的聚糖歸為高置信度類別。在覆蓋度方面，這些高置信度糖蛋白涵蓋了UniProtKB中已審閱N-糖蛋白的63.5%，同時新發現了2,795個此前未在蛋白水平注釋的糖蛋白；與MSFragger-Glyco、Byonic、pGlyco3等其他主流軟件的比較顯示各工具鑒定結果存在互補性，而基序分析確認了N-X-T序列偏好高于N-X-S的已知規律。這一系列數據表明，本研究所構建的圖譜不僅在數量上實現突破，更在結構分辨率和鑒定可信度上達到了新的高度，為后續所有組織特異性分析和功能解讀奠定了堅實的數據基礎。

圖1、24種小鼠組織的高分辨率N-糖蛋白組綜合圖譜

2、組織間糖基化鑒定數量的差異及其影響因素

研究人員從定量角度系統比較了24種小鼠組織在糖基化鑒定深度上的差異，并驗證了數據集的可靠性與技術穩定性。在鑒定數量方面，各組織間呈現出巨大懸殊：膽囊因樣本量限制未進行高pH分級，僅鑒定出1,275個完整糖肽和284個糖蛋白，而腎臟則高達11,723個糖肽和1,400個糖蛋白——對匹配組織的對比分析證實，分級處理可顯著提高糖肽、糖蛋白、糖基化位點和聚糖各維度的鑒定數量，說明樣本分級深度是影響鑒定覆蓋度的重要因素。值得注意的是，即便在相同次數的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析條件下，不同組織的鑒定數仍差異顯著：肝臟的糖蛋白和糖肽鑒定數量最多，而精囊則最少，這一趨勢與既往多組織蛋白質組學研究中蛋白豐度的組織間分布規律高度一致，提示組織固有的糖蛋白表達豐度差異是決定鑒定數量的內在因素。在數據可靠性驗證方面，同一樣品相同餾分的重復質譜分析顯示，聚糖層面和糖基化位點層面的相關系數分別達到0.59–0.88和0.61–0.83，表明技術重復性良好；更為關鍵的是，組織間的變異幅度遠大于技術重復間的波動，這有力地證明觀察到的組織特異性糖基化模式并非由實驗操作或儀器誤差引起，而是反映了真實的生物學差異。綜上所述，通過對鑒定深度的影響因素分析和技術重復性評估，為后續所有跨組織比較和生物學發現提供了堅實的數據質量保障。

圖2、24種小鼠組織中不同的聚糖結構模式與亞結構特征

3、組織間聚糖多樣性與結構復雜度的差異模式

利用腎臟數據量大的優勢，作者進一步探究了性別對糖基化的潛在影響；聚焦于不同小鼠組織在聚糖結構多樣性與復雜度上的特征差異，揭示了組織特異性的糖基化規律。在糖基化位點數量上，腎臟以2,133個糖基化位點修飾以898種獨特聚糖居首，這既受質譜分析深度影響，也反映了腎臟固有的糖蛋白豐富度；相比之下，神經系統七個腦區的糖基化位點數量中等（1,322至1,714個），卻展現出最高的聚糖結構多樣性（每腦區818至992種獨特聚糖），其聚糖/糖基化位點比值高達0.54至0.75，遠高于腎臟的0.42和肝臟的0.25，表明神經組織中每個糖基化位點平均攜帶更多種類的聚糖。尤其值得注意的是，神經組織中單個糖基化位點最多可攜帶257至367種不同聚糖結構，微觀不均一性遠超過其他組織。異構體分析進一步揭示了這一特征的組織偏好性——同一聚糖組成在不同組織中可擴展為6至12個結構異構體，其中神經系統含有最多的異構體，這些結構異構體可通過低能HCD譜圖中特征性的B/Y離子以及C18色譜保留時間差異進行明確區分。在聚糖結構復雜度方面，神經系統聚糖以單天線和二天線為主（復雜度低），而二天線和三天線聚糖主導大多數組織，三天線和四天線聚糖則在胰腺和精囊等外分泌器官中尤為豐富，高分支（四天線及以上）聚糖多見于胃和腸組織。這些差異提示聚糖結構復雜度與組織的特定生理功能密切關聯——神經系統偏好低復雜度但高多樣性的聚糖可能服務于精細的神經信號調控，而外分泌器官和消化道的高分支聚糖則與其分泌功能或黏膜屏障保護需求相適應。綜合而言，通過對聚糖數量、多樣性和結構復雜度的多維比較，描繪了組織特異性糖基化的基本輪廓，為后續深入分析特定結構模塊的分布規律奠定了基礎。

圖3、24種小鼠組織中不同亞細胞定位間N-聚糖的保守性與多樣性

4、不同組織中糖基化和糖蛋白的功能特異性

利用腎臟數據量大的優勢，系統探究了雌雄小鼠之間的N-糖基化差異，揭示了性別對糖基化修飾的精細調控作用。在糖肽、糖基化位點和糖蛋白的總體水平上，雌雄兩性高度相似，重疊率與相關性均表現良好，表明性別并非決定糖基化整體格局的主要因素。然而，在聚糖修飾的精細層面，差異依然清晰可辨：雌性腎臟明顯富集含有LacdiNAc和Neu5Ac（N-乙酰神經氨酸）的聚糖結構，而雄性腎臟則呈現出更多Neu5Gc（N-羥乙酰神經氨酸，為小鼠有的唾液酸類型）修飾的聚糖。功能富集分析進一步揭示了這些差異的潛在生物學意義——雌性富集的糖蛋白主要與免疫應答和生殖過程相關，而雄性富集的糖蛋白則傾向于參與代謝調控和細胞定位等基礎功能。這些發現表明，盡管兩性在糖基化整體特征上高度一致，性激素可能通過調控特定糖基轉移酶的表達水平或催化活性，在聚糖的分支延伸和末端修飾層面產生細微但具有功能相關性的差異。值得強調的是，這些性別差異性聚糖修飾并非隨機分布，而是與特定的生物學通路緊密關聯，提示糖基化可能參與了性激素介導的器官功能調節。這為后續研究提供了重要啟示：在進行組織糖基化研究時，性別是一個不可忽視的變量，尤其當研究聚焦于免疫、代謝和生殖相關功能時，雌雄差異可能對結論產生潛在影響。

圖4、不同組織中共同表達糖蛋白的聚糖結構比較

5、組織特異性聚糖結構特征及其酶學調控基礎

結果展示了24種小鼠組織中具代表性的高豐度聚糖結構，并揭示了其與糖基轉移酶表達之間的內在關聯。首先，作者提取各組織中按修飾糖基化位點數量十的N-聚糖（排除常見的寡甘露糖型），發現不同組織呈現出鮮明的結構偏好：神經組織和腎臟共同富集核心巖藻糖基化的平分型聚糖；精囊雖與腎臟均有高水平Lewis結構，但平分型聚糖在精囊中極為罕見；肝臟和血清以低核心巖藻糖的唾液酸化復雜型為主；睪丸特異性富集末端GlcNAc；胰腺、腸、結腸和胃等消化器官共同富集末端半乳糖，但胰腺以雜合型為主，消化組織則攜帶平分型核心，精囊則以末端半乳糖的強巖藻糖基化為特征而不含平分型結構。為量化這些差異，作者將鑒定的聚糖分解為3種類型、4種核心結構和17種分支結構進行系統統計：在聚糖類型上，血清以復雜型占絕對優勢（74.9%），睪丸以寡甘露糖型為主（38.1%），胰腺雜合型豐富（30.7%）；在核心結構上，Core I在血清和肝臟中最高，Core II富集于精囊、心臟和肺，Core III在神經組織和消化器官中突出，而Core IV（巖藻糖化平分型）則特異性富集于腦區（平均29.4% vs 全組織13.1%）；在分支結構上，神經系統以末端GlcNAc、Lewis表位和Neu5Ac為主（缺乏Neu5Gc），肝/血清以Neu5Gc為主，心臟/肌肉富集唾液酸化LacNAc，消化器官富集LacdiNAc，精囊高表達Lewis?表位。為探究這些結構差異的分子機制，作者利用公共RNA-seq數據繪制了209個糖基轉移酶（GT）的組織表達熱圖，結果顯示這些酶呈現明顯的組織分辨表達模式。其中，Mgat3（合成平分型核心的酶）在腦區的高表達與Core III/IV的富集高度一致，Fut9（合成Lewis X的酶）在腎臟和腦區的高表達也與其相應聚糖的分布相吻合，從轉錄調控層面為組織特異性聚糖結構模式提供了直接的酶學解釋。綜上所述，通過對聚糖結構模塊的組織分布統計和GT表達關聯分析，建立起了從“聚糖結構差異"到“酶表達差異"的因果鏈條，為理解組織特異性糖基化的調控機制奠定了分子基礎。

圖5、位點特異性N-糖基化作為組織分化的分子標簽

6、亞細胞定位對糖基化保守性與多樣性的約束作用

隨后，研究人員系統探討了糖蛋白的亞細胞定位如何在其糖基化模式的保守性與多樣性之間發揮關鍵約束作用。亞細胞定位分析顯示鑒定到的糖蛋白主要分布于內質網（444個）、高爾基體（311個）和質膜（169個）。不同細胞器中的糖蛋白呈現截然不同的糖基化特征：內質網定位者主要攜帶寡甘露糖型簡單聚糖，與N-糖基化在內質網啟動并完成早期加工的合成路徑一致；細胞外基質和質膜定位者則以復雜型聚糖為主，富含分支及末端唾液酸/巖藻糖修飾，代表高爾基體充分加工后的成熟狀態。GO富集分析顯示內質網糖蛋白主要參與蛋白折疊、質量控制和囊泡運輸等保守功能，而質膜糖蛋白則執行信號轉導、離子運輸和細胞類型特異性過程等多樣化功能，提示糖基化復雜度與功能多樣性正相關。跨組織比較顯示，盡管組織間差異存在，內質網和質膜各自的基本糖基化特征在所有組織中高度保守。選取在≥12個組織中共同表達的糖蛋白按亞細胞定位分組后計算組織間聚糖相似性，發現內質網定位者相似性最高（受保守合成途徑限制），細胞外基質和質膜定位者相似性最di（適應特化胞外功能）。表明亞細胞定位通過在合成路徑上的加工限制和功能需求上的選擇壓力，在糖基化的保守性與多樣性調控中發揮決定性作用。

圖6、24種小鼠組織中組織富集聚糖的功能分析

7、共同表達蛋白的組織特異性重塑及其組織身份判別能力

進一步的分析論證了位點特異性糖基化在組織功能適應性和組織身份識別中的核心地位。首先，即使同一蛋白骨架在不同組織中也經歷系統的糖基化“改造"——在62個于至少12個組織中共同檢測到的糖蛋白中，其附著的聚糖結構呈現顯著的組織依賴性差異，且這種差異在24個通用表達蛋白中更為突出，僅分析這些共享蛋白的糖基化變體即可獲得比全局聚糖分析更精準的組織聚類結果。以甘露糖-6-磷酸受體(M6pr)為例，其同一糖基化位點Asn-84在肝臟以高度唾液酸化的復雜型為主（延長蛋白半衰期、增強內吞回收），在胰腺以唾液酸化的雜合型為主，在精囊則以無唾液酸的雜合型為主，清晰展示了同一蛋白在不同生理環境中發生的“糖型開關"現象；但細胞表面透明質酸酶(Cemp2)的Asn-914位點在所有組織中保持高度保守，說明糖基化重塑是位點特異性的而非全或無現象。隨后，在組織身份識別層面，通過無監督聚類和PCA分析證明，基于位點特異性完整糖肽的聚類能將24種組織按解剖系統和功能wan美歸類（腦區聚為一簇、血清獨立分離、消化和生殖器官各自成簇），其區分度遠優于基于糖蛋白整體或游離聚糖的聚類。作者還發現每個組織都擁有獨特的“私有"聚糖結構，且同一聚糖組成的不同異構體在不同組織中富集模式截然不同——若僅分析組成則無法區分組織，只有引入異構體結構信息才能清晰鑒別。這些發現共同確立了“位點特異性糖基化"作為組織身份高精度分子標簽的核心地位，揭示了糖基化通過在不改變氨基酸序列的前提下改變糖鏈結構來適配不同組織生理需求的調控邏輯。

8、糖基化位點上的非隨機聚糖共現規律

作者對每個具有至少10個聚糖觀察值的糖基化位點進行了共現網絡分析，發現絕大多數頻繁共存的聚糖對之間的差異僅限于末端單糖：特別是僅相差1個唾液酸（S）或1個巖藻糖（F），而核心骨架（己糖H和N-乙酰葡萄糖胺G）保持不變。這種以唾液酸變異為主的共現模式在血清、肝臟、心臟、卵巢和肌肉等組織中尤為突出，二唾液酸化、單唾液酸化和去唾液酸化的二天線聚糖經常以高概率共存于同一糖基化位點，提示微觀不均一性主要源于末端單糖的動態添加或去除，而非核心結構的劇烈改變。更為深入的亞結構共現分析揭示了核心與分支之間的偏好性配對規則：Core I主要搭配甘露糖分支，Core II偏向LacNAc和巖藻糖化分支，而Core III和Core IV（平分型核心）則傾向于與較少的分支結構共存。這一觀察與已知的酶學抑制機制高度吻合——平分型GlcNAc可抑制GnTII、GnTIV、GnTV和FUT8等分支延長酶的活性，從而限制聚糖的進一步延伸。分支–分支共現模式同樣顯示出協調調控的特征：復雜分支常與簡單分支（如單GlcNAc或LacNAc）共存，而polySia與Lewis結構的頻繁共現則可能涉及細胞信號傳導和免疫調節等協同功能。綜合這些多層次網絡分析，本研究得出核心結論：糖基化位點上的微觀不均一性并非隨機的譜圖噪音，而是受糖基轉移酶的底物偏好和結構約束共同塑造、具有高度組織規律性的有序組合系統。

四、研究的意義及不足

本研究繪制了小鼠24種組織的高分辨率N-糖蛋白組圖譜，在數據規模、結構解析深度和鑒定可信度上均實現突破，了填補系統性糖蛋白組研究的空白。核心發現包括：糖基化具有強烈組織特異性，富集聚糖結構與各組織生理功能密切相關；亞細胞定位對糖基化多樣性與保守性起關鍵約束作用；同一蛋白骨架可發生組織依賴性“糖型開關"，且糖肽在區分組織身份方面遠優于蛋白質或游離聚糖。該資源為理解糖基化在組織分化、蛋白功能微調中的作用提供了系統性框架，對生物標志物發現和藥物開發具有推動作用。然而研究也有一些不足之處，包括：樣本混合策略掩蓋個體差異，質譜深度在部分組織不一致，未覆蓋硫酸化等罕見修飾，缺乏功能驗證實驗，且小鼠與人存在Neu5Gc等物種差異，限制了直接臨床轉化。未來需通過單細胞/空間糖蛋白組學、跨物種比較和疾病模型擴展進一步深化研究。